以往癌症和微生物之间的研究主要集中在胃肠道微生物群的失调上，但是，已有证据支持肿瘤内微生物群也是肠外肿瘤的一个重要组成部分，那么肿瘤内微生物能否以及如何作为肿瘤患者的预后预测生物标志物？今天给大家分享一篇肿瘤内微生物组的预后模型生信分析文章，这篇文章2023年3月14日发表在Frontiers in Immunology（Q1, IF=7.3）上：Integrating bulk and single-cell RNA sequencing data reveals the relationship between intratumor microbiome signature and host metabolic heterogeneity in breast cancer.
PART.01 研究背景
微生物群是人体不可忽视的组成部分，对宿主代谢、免疫系统和疾病进展有显著影响。最近文献支持肿瘤内微生物群也是肠外肿瘤的一个重要组成部分的概念。细胞外或细胞内的微生物群落具有代谢活性和免疫反应性。癌症的代谢微环境可能受到肠道或肿瘤内微生物群的调节和重塑。
人类乳腺组织并不像以前认为的那样无菌，与人体中的其他组织相比，它包含了一个独特的微生物群落。以往研究提出了肿瘤内微生物与癌症代谢的两两相互作用的可能重要性。但是，肿瘤内微生物与癌症代谢关系的研究较少，仍有待进一步探究。
PART.02 研究思路
（1）从公共数据集中检索了1085例数据标准化肿瘤内微生物丰度的乳腺癌患者和32个单细胞RNA测序样本；
（2）使用基因集变异分析（GSVA）来评估乳腺癌样本的各种代谢活动；
（3）应用Scissor从单细胞数据中识别与微生物相关的细胞亚群；
（4）进行全面的生物信息学分析，探讨乳腺癌中宿主和微生物之间的关系。
PART.03 研究结果
01肿瘤内微生物丰度与代谢活性的关系
19个微生物属与8种主要代谢途径的活性显著相关（图1A）。肿瘤组织中存在的微生物群与乳腺组织不同（图1B）。单因素生存分析显示弯曲杆菌、糖化杆菌、棕榈芽孢杆菌、Lawsonia和Bulleidia是乳腺癌患者的预后因素（图1C）。图1D描述了两个簇之间微生物丰度和异质代谢活性的差异，分析了不同聚类间的代谢物分布，并显示了差异代谢物（图1E）。Kaplan-Meier生存曲线显示，聚类2的生存率较低（图2A）。两个聚类表现出不同的PR、HER2和分子亚型状态（图2C）。
图1. 乳腺癌患者肿瘤内微生物与代谢途径的关系
图2. 生存分析和与微生物相关的突变景观
02生物功能富集分析和WGCNA
GSEA结果显示，微生物丰度相对较高的C2患者抑制了对共生体防御反应，GO分析进一步揭示了聚簇相关的信号通路包括调节细胞粘附、肌醇磷酸盐代谢、T细胞分化等（图3B)。
基于KEGG数据库对两个模块中的基因进行了通路富集分析，包含肌醇磷酸盐代谢、核苷酸代谢、致病性大肠杆菌感染和耐药性（图3D）。生存分析显示，高弯曲杆菌丰度和肌醇磷酸盐代谢活性的患者的OS最差（图2B）。
图3. WGCNA和生物功能分析
03在单细胞测序下定量代谢活性
经过降维、细胞聚类和细胞类型注释，细胞分为7种类型，包括T和NK细胞、B细胞、髓细胞、上皮细胞、内皮细胞、浆细胞和成纤维细胞（图4A-C），考虑到弯曲杆菌与WGCNA模块特征基因（ME）之间的高度相关性，该属在TCGA-BRCA中的丰富程度通常被选择为表型，从scRNA-seq数据中识别最高度相关的细胞亚群。然后，根据bulk样本的微生物表型对4621个Scissor+细胞和5082个Scissor-细胞进行分类（图4D）。细胞类型比例显示，Scissor+组中T/NK细胞和B细胞的比例高于Scissor-组（图4F、H）。
在图4E中展示了代谢途径，包括糖酵解、脂肪酸代谢和异生物代谢。此外，在Scissor+/-细胞中观察到通路的失调，包括对细菌的反应、抗菌体液反应、干扰素和白细胞介素信号通路（图4G）。
图4. 单细胞测序Scissor算法和代谢活性的结果
04代谢相关微生物模型的建立与验证
将TCGA-BRCA患者随机分为训练集和验证集两组，使用多变量Cox比例风险模型来评估危险因素构建风险评分，基于风险评分将患者分为低危组和高危组。风险评分较高的患者预后明显较差（图5A-C）。该模型的10年AUC值为0.662（图5E）。根据微生物评分和其他病理特征建立一个列线图来预测总生存率（图5F）。预测与实际观测之间具有较高的一致性（图5G）。
图5. 微生物风险模型和列线图的建立和验证
05与代谢相关微生物组相关的异常信号通路和免疫微环境
微生物评分与通路扰动有关（图6A）。弯曲杆菌丰度和微生物评分与resF_up和resF评分呈负相关，提示代谢相关微生物参与免疫治疗耐药性（图6B)。Mantel试验结果显示，门水平上的代谢相关微生物与记忆B细胞、静息记忆CD4+ T细胞、T滤泡辅助细胞、调节性T细胞和活化的NK细胞显著相关（图6D）。这些结果表明，肿瘤内微生物群与宿主免疫微环境的异质性有关。
06甲基杆菌与TME中CD8+TRM细胞减少有关
利用OncoPredict包基于微生物丰度预测化疗的潜在反应。药物-微生物相关系数大于0.4的绝对值如图6C所示。代谢相关微生物属，特别是弯曲杆菌、亚硝化杆菌和类单纯疱疹病毒属，与唑来膦酸钠、阿培利司、氟维司群、奈拉滨等的药物敏感性有关。
图6. 肿瘤免疫微环境及药敏性与微生物丰度的关系
PART.04 总结
该文章研究了肿瘤内微生物和癌症代谢之间的关系，并构建与代谢相关的微生物特征，探讨其潜在的预后价值，随后分析了乳腺微生物组与基因突变和免疫微环境的关系。此外，根据微生物丰度评估了对免疫治疗和化疗药物的反应。这些发现揭示了肿瘤内代谢相关微生物的图谱，提供了新的乳腺癌治疗的思路。
这篇文章的优点在于：
（1）该文章聚焦于肿瘤内微生物进行预后模型构建，具有很强的创新性；
（2）通过微生物预后模型构建，具有很好临床转化价值，临床意义较强。
但是该文章仍然有一定的局限性：
（1）因果关系尚未阐明；
（2）由于构建预测模型是回顾性研究队列，该模型的稳健性有一定限制；
（3）肿瘤内微生物如何与宿主的代谢和免疫系统相互作用，有待进一步的研究。
课题设计拓展
基于这篇文章可以从以下角度进行后续国自然前期基础的铺垫：
（1）通过免疫组化、FISH等方法进一步明确乳腺癌肿瘤组织内微生物的定位是否在瘤内；
（2）小鼠模型中测试不同的抗生素组合和给药途径来选择性地消除肿瘤内微生物，观察肿瘤生长变化，明确肿瘤内微生物中肿瘤进展的影响；
（3）对该文章获得的预后模型中的关键细菌，进行绝对定量验证其丰度差异进一步筛选；
（4）通过培养组学技术获取肿瘤组织中活菌，再利用MALDI-TOF质谱和16S rRNA基因测序（或宏基因组测序）对分离培养得到的代表性菌落进行菌种鉴定；
（5）建立基质类器官共培养系统，用筛选的关键细菌菌株接种肿瘤细胞，检测其侵袭效率和肿瘤细胞集落生长情况。
